工作原理

1983年，WALZ公司首席科學家，德國烏茲堡大學教授Ulrich Schreiber博士利用調(diào)制技術(shù)和飽和脈沖技術(shù)，設計制造了全世界第一臺脈沖振幅調(diào)制（Pulse-Amplitude-Modulation，PAM）熒光儀——PAM-101/102/103。

所謂調(diào)制技術(shù)，就是說用于激發(fā)熒光的測量光具有一定的調(diào)制（開/關）頻率，檢測器只記錄與測量光同頻的熒光，因此調(diào)制熒光儀允許測量所有生理狀態(tài)下的熒光，包括背景光很強時。正是由于調(diào)制技術(shù)的出現(xiàn)，才使得葉綠素熒光由傳統(tǒng)的“黑匣子”（避免環(huán)境光）測量走向了野外環(huán)境光下測量，由生理學走向了生態(tài)學。

經(jīng)過充分暗適應后，所有電子門均處于開放態(tài)，打開測量光得到Fo，此時給出一個飽和脈沖，所有的電子門就都將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了熒光和熱，此時得到的葉綠素熒光為Fm。根據(jù)Fm和Fo可以計算出PS II的最大量子產(chǎn)量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了植物的潛在最大光合能力。

所謂飽和脈沖技術(shù)，就是打開一個持續(xù)時間很短（一般小于1 s）的強光關閉所有的電子門（光合作用被暫時抑制），從而使葉綠素熒光達到最大。飽和脈沖（Saturation Pulse, SP）可被看作是光化光的一個特例。光化光越強，PS II釋放的電子越多，PQ處累積的電子越多，也就是說關閉態(tài)的電子門越多，F(xiàn)越高。當光化光達到使所有的電子門都關閉（不能進行光合作用）的強度時，就稱之為飽和脈沖。

打開飽和脈沖時，本來處于開放態(tài)的電子門將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了葉綠素熒光和熱，F(xiàn)達到最大值。

在光照下光合作用進行時，只有部分電子門處于開放態(tài)。如果給出一個飽和脈沖，本來處于開放態(tài)的電子門將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了葉綠素熒光和熱，此時得到的葉綠素熒光為Fm’。根據(jù)Fm’和F可以求出在當前的光照狀態(tài)下PS II的實際量子產(chǎn)量Yield=ΦPSII=ΔF/Fm’=(Fm’-F)/Fm’，它反映了植物目前的實際光合效率。

光照狀態(tài)下打開飽和脈沖時，電子門被完全關閉，光合作用被暫時抑制，也就是說光化學淬滅被全部抑制，但此時熒光值還是比Fm低，也就是說還存在熒光淬滅，這些剩余的熒光淬滅即為非光化學淬滅。淬滅系數(shù)的計算公式為：qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’)；qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo)；NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1。

在光照下光合作用進行時，只有部分電子門處于關閉態(tài)，實時熒光F比Fm要低，也就是說發(fā)生了熒光淬滅（quenching）。植物吸收的光能只有3條去路：光合作用、葉綠素熒光和熱。根據(jù)能量守恒：1=光合作用+葉綠素熒光+熱?？梢缘贸觯喝~綠素熒光=1－光合作用－熱。也就是說，葉綠素熒光產(chǎn)量的下降（淬滅）有可能是由光合作用的增加或熱耗散的增加引起的。由光合作用的引起的熒光淬滅稱之為光化學淬滅（photochemical quenching, qP）；由熱耗散引起的熒光淬滅稱之為非光化學淬滅（non-photochemical quenching, qN或NPQ）。光化學淬滅反映了植物光合活性的高低；非光化學淬滅反映了植物耗散過剩光能為熱的能力，也就是光保護能力。

根據(jù)PS II的實際量子產(chǎn)量ΔF/Fm’和光合有效輻射（Photosynthetically Active Radiation, PAR）還可計算出光合電子傳遞的相對速率rETR=ΔF/Fm’·PAR·0.84·0.5。其中0.84是植物的經(jīng)驗性吸光系數(shù)，0.5是假設植物吸收的光能被兩個光系統(tǒng)均分。

當F達到穩(wěn)態(tài)后關閉光化光，同時打開遠紅光（Far-red Light, FL）（約持續(xù)3－5 s），促進PS I迅速吸收累積在電子門處的電子，使電子門在很短的時間內(nèi)回到開放態(tài)，F(xiàn)回到最小熒光Fo附近，此時得到的熒光為Fo’。由于在野外測量Fo’不方便，因此野外版的調(diào)制熒光儀（除PAM-2100和WATER-PAM）外，多數(shù)不配置遠紅光。此時可以直接利用Fo代替Fo’來計算qP和qN，盡管得到的參數(shù)值有輕微差異，但qP和qN的變化趨勢與利用Fo’計算時是一致的。由于NPQ的計算不需Fo’，近10幾年來得到了越來越廣泛的應用。

2常用型號

葉綠素 - 分類

葉綠素分為葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c、葉綠素d、原葉綠素和細菌葉綠素等。

葉綠素名稱存在場所最大吸收光帶

葉綠素a所有綠色植物中紅光和藍紫光

葉綠素b高等植物、綠藻、眼蟲藻、管藻紅光和藍紫光

葉綠素c硅藻、甲藻、褐藻紅光和藍紫光

葉綠素d紅藻紅光和藍紫光

原葉綠素黃化植物（幼苗期）近于紅光和藍紫光

細菌葉綠素紫色細菌紅光和藍紫光

葉綠素 - 化學結(jié)構(gòu)

葉綠素分子結(jié)構(gòu)

19世紀初，俄國化學家、色層分析法創(chuàng)始人M.C.茨韋特用吸附色層分析法證明高等植物葉子中的葉綠素有兩種成分。德國H.菲舍爾等經(jīng)過多年的努力，弄清了葉綠素的復雜的化學結(jié)構(gòu)。1960年美國R.B.伍德沃德領導的實驗室合成了葉綠素a。至此,葉綠素的分子結(jié)構(gòu)得到定論。

葉綠素分子是由兩部分組成的：核心部分是一個卟啉環(huán)(porphyrin ring)，其功能是光吸收；另一部分是一個很長的脂肪烴側(cè)鏈，稱為葉綠醇(phytol)，葉綠素用這種側(cè)鏈插入到類囊體膜。與含鐵的血紅素基團不同的是，葉綠素卟啉環(huán)中含有一個鎂原子。葉綠素分子通過卟啉環(huán)中單鍵和雙鍵的改變來吸收可見光。各種葉綠素之間的結(jié)構(gòu)差別很小。如葉綠素a和b僅在吡咯環(huán)Ⅱ上的附加基團上有差異：前者是甲基，后者是甲醛基。細菌葉綠素和葉綠素a不同處也只在于卟啉環(huán)Ⅰ上的乙烯基換成酮基和環(huán)Ⅱ上的一對雙鍵被氫化。

葉綠素 - 化學性質(zhì)

高等植物葉綠體中的葉綠素主要有葉綠素a 和葉綠素b 兩種。它們不溶于水，而溶于有機溶劑，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等。葉綠素a分子式：C55H72O5N4Mg；葉綠素b分子式：C55H70O6N4Mg。在顏色上，葉綠素a 呈藍綠色，而葉綠素b 呈黃綠色。按化學性質(zhì)來說，葉綠素是葉綠酸的酯，能發(fā)生皂化反應。葉綠酸是雙羧酸，其中一個羧基被甲醇所酯化，另一個被葉醇所酯化。

葉綠素分子含有一個卟啉環(huán)的“頭部”和一個葉綠醇的“尾巴”。鎂原子居于卟啉環(huán)的中央，偏向于帶正電荷，與其相聯(lián)的氮原子則偏向于帶負電荷，因而卟啉具有極性，是親水的，可以與蛋白質(zhì)結(jié)合。葉醇是由四個異戊二烯單位組成的雙萜，是一個親脂的脂肪鏈，它決定了葉綠素的脂溶性。葉綠素不參與氫的傳遞或氫的氧化還原，而僅以電子傳遞（即電子得失引起的氧化還原）及共軛傳遞（直接能量傳遞）的方式參與能量的傳遞。

卟啉環(huán)中的鎂原子可被氫離子、銅離子、鋅離子所置換。用酸處理葉片，氫離子易進入葉綠體，置換鎂原子形成去鎂葉綠素，使葉片呈褐色。去鎂葉綠素易再與銅離子結(jié)合，形成銅代葉綠素，顏色比原來更穩(wěn)定。人們常根據(jù)這一原理用醋酸銅處理來保存綠色植物標本。 葉綠醇是親脂的脂肪族鏈，由于它的存在而決定了葉綠素分子的脂溶性，使之溶于丙酮、酒精、乙醚等有機溶劑中。由于在結(jié)構(gòu)上的差別，葉綠素a呈藍綠色，b呈黃綠色。在光下易被氧化而退色。葉綠素是雙羧酸的酯，與堿發(fā)生皂化反應。

葉綠素不很穩(wěn)定，光、酸、堿、氧、氧化劑等都會使其分解。酸性條件下，葉綠素分子很容易失去卟啉環(huán)中的鎂成為去鎂葉綠素。葉綠素溶液能進行部分類似光合作用的反應，在光下使某些化合物氧化或還原。人工制備的葉綠素膜在光下能產(chǎn)生光電位和光電流，也能催化某些氧化還原反應。

葉綠素 - 光和作用

光和作用

光合作用是指綠色植物通過葉綠體，利用光能，把二氧化碳和水轉(zhuǎn)化成儲存著能量的有機物，并且釋放出氧的過程。光合作用的第一步是光能被葉綠素吸收并將葉綠素離子化。產(chǎn)生的化學能被暫時儲存在三磷酸腺苷(ATP)中，并最終將二氧化碳和水轉(zhuǎn)化為碳水化合物和氧氣。

1864年，德國科學家薩克斯做了這樣一個實驗：把綠色葉片放在暗處幾小時，目的是讓葉片中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗掉。然后把這個葉片一半曝光，另一半遮光。過一段時間后，用碘蒸氣處理葉片，發(fā)現(xiàn)遮光的那一半葉片沒有發(fā)生顏色變化，曝光的那一半葉片則呈深藍色。這一實驗成功地證明了綠色葉片在光合作用中產(chǎn)生了淀粉。

1880年，德國科學家恩吉爾曼用水綿進行了光合作用的實驗：把載有水綿和好氧細菌的臨時裝片放在沒有空氣并且是黑暗的環(huán)境里，然后用極細的光束照射水綿。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，好氧細菌只集中在葉綠體被光束照射到的部位附近；如果上述臨時裝片完全暴露在光下，好氧細菌則集中在葉綠體所有受光部位的周圍。恩吉爾曼的實驗證明：氧是由葉綠體釋放出來的，葉綠體是綠色植物進行光合作用的場所?！?/p>

將一片脫去淀粉的紫羅蘭葉片放在陽光下數(shù)小時之后用碘試劑檢測，可以發(fā)現(xiàn)只有葉片上綠色的區(qū)域變色而白色區(qū)域沒有，也就是說只有綠色區(qū)域有淀粉存在。這顯示了光合作用在缺乏葉綠素的情況下無法進行，葉綠素存在是光合作用的必要條件。

葉綠素 - 熒光現(xiàn)象和磷光現(xiàn)象

葉綠素熒光儀

葉綠素的可見光波段的吸收光譜，在藍光和紅光處各有一顯著的吸收峰。吸收峰的位置和消光值的大小隨葉綠素種類不同而有所不同。葉綠素a最大的吸收光的波長在420-663nm，葉綠素b 的最大吸收波長范圍在460-645nm。當葉綠素分子位于葉綠體膜上時，由于葉綠素與膜蛋白的相互作用，會使光吸收的特性稍有改變。

葉綠素的酒精溶液在透射光下為翠綠色，而在反射光下為棕紅色。這個紅光就是葉綠素受光激發(fā)后發(fā)射的熒光。這個現(xiàn)象就是熒光現(xiàn)象。其主要原理是由于葉綠素有兩個不同的吸收峰。葉綠素吸收光的能力極強，如果把葉綠素的丙酮提取液放在光源與分光鏡之間，可以看到光譜中有些波長的光被吸收了。因此，在光譜上就出現(xiàn)了黑線或暗帶，這種光譜叫吸收光譜。葉綠素吸收光譜的最強區(qū)域有兩個：一個是在波長為640nm-660nm的紅光部分，另一個在波長為430nm-450nm的藍紫光部分。對其他光吸收較少，其中對綠光吸收最少，由于葉綠素吸收綠光最少，所以葉綠素的溶液呈綠色。葉綠素的丙酮提取液在透射光下是翠綠色的，而在反射光下是綜紅色的。 葉綠素溶液的熒光可達吸收光的10%左右。而鮮葉的熒光程度較低，指占其吸收光的0.1%-1%左右。

熒光效應在植物生理學中有廣泛的應用。用這個效應可以研究植物的抗逆生理。因為在逆境下，植物的葉綠素會發(fā)生變換，研究其熒光，可以作為植物受逆境脅迫程度的指標。另外，還有一個磷光效應。就是當熒光出現(xiàn)后，立即中斷光源，用靈敏的光學儀器還可在短時間內(nèi)看到微弱紅光，這就是磷光。

葉綠素 - 生物合成與代謝

葉綠素a的生物合成途徑，是由琥珀酰輔酶A和甘氨酸縮合成δ-氨基乙酰丙酸，兩個δ-氨基乙酰丙酸縮合成吡咯衍生物膽色素原，然后再由4個膽色素原聚合成一個卟啉環(huán)──原卟啉Ⅳ，原卟啉Ⅳ是形成葉綠素和亞鐵血紅素的共同前體，與亞鐵結(jié)合就成亞鐵血紅素，與鎂結(jié)合就成鎂原卟啉。鎂原卟啉再接受一個甲基，經(jīng)環(huán)化后成為具有第Ⅴ環(huán)的原脫植醇基葉綠素，后者經(jīng)光還原、酯化等步驟而形成葉綠素a。

落葉

葉綠素在活體內(nèi)也和其他物質(zhì)一樣處于不斷更新狀態(tài)。它被葉綠素酶分解，或經(jīng)光氧化而漂白。深秋時許多樹種葉片呈美麗的紅色，就是因為這時葉綠素降解速度大于合成速度，含量下降，原來被葉綠素所掩蓋的類胡蘿卜素、花色素的顏色顯示出來的緣故。

在植物衰老和儲藏過程中，酶能引起葉綠素的分解破壞。這種酶促變化可分為直接作用和間接作用兩類。直接以葉綠素為底物的只有葉綠素酶，催化葉綠素中植醇酯鍵水解而產(chǎn)生脫植醇葉綠素。脫鎂葉綠素也是它的底物，產(chǎn)物是水溶性的脫鎂脫植葉綠素，它是橄欖綠色的。葉綠素酶的最適溫度為60-82℃，100℃時完全失活。起間接作用的有蛋白酶、酯酶、脂氧合酶、過氧化物酶、果膠酯酶等。蛋白酶和酯酶通過分解葉綠素蛋白質(zhì)復合體，使葉綠素失去保護而更易遭到破壞。脂氧合酶和過氧化物酶可催化相應的底物氧化，其間產(chǎn)生的物質(zhì)會引起葉綠素的氧化分解。果膠酯酶的作用是將果膠水解為果膠酸，從而提高了質(zhì)子濃度，使葉綠素脫鎂而被破壞。

在活體綠色植物中，葉綠素既可發(fā)揮光合作用，又不會發(fā)生光分解。但在加工儲藏過程中，葉綠素經(jīng)常會受到光和氧氣作用，被光解為一系列小分子物質(zhì)而褪色。光解產(chǎn)物是乳酸、檸檬酸、琥珀酸、馬來酸以及少量丙氨酸。因此，正確選擇包裝材料和方法以及適當使用抗氧化劑，以防止光氧化褪色。

葉綠素 - 提取

綠葉

葉綠素提取的準備工作是在一個半暗的房間里，室溫保持在25℃。提取步驟如下：

(1) 取1000克新鮮的綠葉，在韋氏攪切器中粉碎。

(2)將粉碎的1000克綠葉放進加有少量的碳酸鈣的丙酮中(溫度20℃)進行萃取，直到過濾、清洗后的葉子碎片為無色。

(3)將過濾后的丙酮提取液放到盛有1升石油醚和100ml丙酮的漏斗中，然后輕輕地旋轉(zhuǎn)，同時加放蒸餾水直到分層為止。水層的大部分丙酮和水溶雜質(zhì)被丟棄，只剩石油醚溶液。

(4)將石油醚溶液用蒸餾水再次凈化后，用含有石油醚和0.01克草酸的200ml80%的甲醇溶液清洗5次以上，最后得到黃綠色懸浮液。

(5)用無水硫酸鈉對懸浮液進行干燥，并將其滲入到3cm厚的蔗糖粉末制成柱中，然后用石油醚清洗沉淀的色素去掉類胡蘿卜素，使之只含有天然的葉綠素。

(6)含有天然葉綠素的蔗糖柱分兩層，綠層有4-10mm的葉綠素b層，另一藍層為2-6mm的葉綠素a層。

(7)將位于藍層正中的部分(約占藍層的一半) 放入醚中，對此懸浮液進行過濾、洗提，用蒸餾水清洗，用硫酸鈉干燥，再用器皿進行過濾后，得到葉綠素a。

(8)將(6)中的綠層中間部分移出，迅速放入醚中過濾、洗提，制成葉綠素b醚溶液。

葉綠素 - 用途

葉綠素產(chǎn)品

造血功能

諾貝爾得獎人Dr.Richard Willstatter和Dr.Hans Fisher發(fā)現(xiàn)：葉綠素的分子與人體的紅血球分子在結(jié)構(gòu)上很是相似，唯一的分別就是各自的核心為鎂原子與鐵原子。因此，飲用葉綠素對產(chǎn)婦與因意外失血者會有很大的幫助。

幫助解除體內(nèi)殺蟲劑與藥物殘渣

營養(yǎng)學家Bernard Jensen博士指出，葉綠素能除去殺蟲劑與藥物殘渣的毒素，并能與輻射性物質(zhì)結(jié)合而將之排出體外。此外，他也發(fā)現(xiàn)一般上健康的人會比病患者擁有較高的血球計數(shù)，但通過吸收大量的葉綠素之后，病患者的血球計數(shù)就會增加，健康狀況也會有所改善。

養(yǎng)顏美膚

新英國醫(yī)藥期刊曾經(jīng)做過這樣的報導：葉綠素有助于克制內(nèi)部感染與皮膚問題。美國外科雜志報導：Temple大學在1200名病人身上，嘗試以葉綠素醫(yī)治各種病癥，效果極佳。

葉綠素 - 新聞動態(tài)

澳研究人員偶然提取到新型葉綠素

澳大利亞悉尼大學生命科學學院研究人員宣布，他們發(fā)現(xiàn)了一種新葉綠素，它在生物能源領域可望擁有廣闊的應用前景。