一、適用范圍

　　本操作方法適用配合飼料、濃縮飼料和單一飼料。

　　二、方法概述及原理

　　飼料中粗蛋白質(zhì)包括真蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩部分含氮物質(zhì)，后者主要包括游離氨基酸、硝酸鹽、銨鹽等，不能或不易被動(dòng)物吸收，故不能反映出飼料蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物的真正營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。本方法是在凱氏定氮方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行相應(yīng)的前處理從而達(dá)到測(cè)定真蛋白的目的。

　　蛋白質(zhì)經(jīng)沸水提取并在一定堿性條件下，能與硫酸銅發(fā)生鹽析作用而析出沉淀，此沉淀物不溶于熱水，而非蛋白氮?jiǎng)t易溶于水，用熱水洗沉淀，將水溶性含氮物洗去，剩下的沉淀物再用凱氏定氮法測(cè)定，得出真蛋白質(zhì)的含量。

　　三、儀器與試劑

　　粉碎機(jī)、40目分樣篩、分析天平(感量0.1mg)、燒杯250ml、玻璃棒、漏斗(直徑10cm)、

　　定性濾紙(中速，12.5cm，15cm)、可控溫干燥箱、Hanon K1100F全自動(dòng)凱氏定氮儀、

　　Hanon SH420石墨消解爐、可控溫電爐

　　濃硫酸(98%)、硫酸銅(分析純)、硫酸銅溶液(10%)、硫酸鉀、氫氧化鈉溶液(40%)、

　　氫氧化鈉溶液(2.5%)、硼酸(20g/L，按混合指示劑：硼酸=1:100加入指示劑)、

　　甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑(1:5)、硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(C(1/2H2SO4)=0.1mol/L)、

　　氯化鋇溶液(5%)

　　四、實(shí)驗(yàn)步驟

　　1. 前處理

　　將風(fēng)干飼料樣品用飼料樣品粉碎機(jī)粉碎，通過(guò)40目(孔徑0.45 mm)篩，制得分析飼料樣本，備用。

　　準(zhǔn)確稱取約0.5g試樣(精確至0.000 1 g)置于250 mL燒杯中，加75mL蒸餾水，加熱至沸，煮沸30min(保持75mL水)，加入2.5 %氫氧化鈉溶液20 mL，10 %硫酸銅溶液20 mL，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆?，微沸一段時(shí)間，冷卻放置超過(guò)2 h。用定性濾紙過(guò)濾，然后用70~80 ℃熱水沖洗沉淀5次以上，用 5%氯化鋇溶液5滴和數(shù)滴鹽酸檢查濾液，直至不生成白色硫酸鋇沉淀。將沉淀和濾紙放在65 ℃烘箱烘干。

　　將干燥后的沉淀連同濾紙一起放入消化管中，加入15mL濃硫酸，3g硫酸鉀，0.2g硫酸銅，放在石墨消解爐上設(shè)置溫度梯度升溫消化(同時(shí)做空白試驗(yàn))。

　　2.真蛋白的測(cè)定

　　將冷卻后的消化管置于K1100F全自動(dòng)凱氏定氮儀上，設(shè)置參數(shù)：硼酸20mL，堿 60mL，稀釋水10mL，蒸餾5min。測(cè)得蛋白質(zhì)含量即為真蛋白含量。

　　五、注意事項(xiàng)

　　1.洗滌時(shí)要用60-80℃左右的熱水，可以減少洗滌次數(shù)。

　　2.必須要洗滌到氯化鋇不再產(chǎn)生白色沉淀為止，以確定非蛋白氮成分洗滌干凈。

　　3.沉淀要盡量烘干。